强直性肌营养不良基因ctg重复数与sep、mep对比分析

　　第二军医大学学报1999年第20卷第9期

崔毅　谢惠君　郑惠民　倪利英　刘莹

　　摘　要　目的：探讨强直性肌营养不良(dm)患者及其家系成员基因ctg重复数的变化与体感诱发电位(sep)、经颅刺激运动诱发电位(mep)的比较。方法：用聚合酶链反应(pcr)扩增及dna杂交法对5例临床诊断dm患者及其中3个家系16名成员进行dm基因ctg重复数和sep、mep测定。结果：10名正常人ctg重复数19～30个，sep、 mep正常5例。 dm患者ctg重复数均在80个以上，其中2例在1 605个以上，明显高于正常人;16名家系成员中除4例正常，余12例ctg重复数均超过正常基因。ctg重复数与临床症状、sep、mep有关。结论：dm基因诊断与其临床诊断、sep、mep相一致。

　　关键词：强直性肌营养不良　ctg重复数　诱发电位

　　强直性肌营养不良(dm)是一种常染色体显性遗传病。国外近年开始寻找其基因内的三核苷酸(胞嘧啶，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，ctg)扩增的重复数工作，而dm蛋白激酶(dmpk)基因的ctg重复数与近年兴起的体感诱发电位(sep)和经颅磁剌激运动诱发电位(mep)对比分析，文献尚无报道。本研究就5例dm住院患者及其中两家系中15名“无症状”个体及1例dm患者的舅父的dm基因ctg重复数与sep、mep进行对比分析，报告如下。

　　1.　材料和方法

　　1.1　临床资料　5例住院临床诊断dm患者(表1:例1，8，18，19，21)及其例1、例8家系中15名“无症状”个体和例19的1名“无症状”舅父(例20)共21人，男15例，女6例，年龄13～76岁，均进行临床检查、dm基因ctg重复数和sep、mep检查。另选择10名15～62岁无神经系统疾病，其三代家系无遗传性疾病的健康人，作为参加本研究各项检测的正常对照组。

　　1.2　操作方法

　　1.2.1　dm基因ctg重复数的测定　(1)人基因组dna的制备:受检者分别抽取10 ml静脉血肝素抗凝，取0.5 ml 肝素抗凝血，加0.5 ml裂解缓冲液混匀，13 000×g离心20 s，吸去上清，沉淀重悬浮于1 ml 裂解缓冲液中，重复2～3次，直至去净红细胞，最后1次离心去上清后，沉淀悬浮于0.1 ml pcr缓冲液中，加蛋白酶k 3μl (10 mg/ml)，水浴后冻存备用。（2）pcr扩增:在pcr热循环仪（美国perkin-elmer公司）上，经改进的dna序列（正链5′-cgaagggtccttgtagccggga-3′和负链5′-catccacgtcagggcctcagc-3′）为引物，反应体系25μl。(3)聚丙烯酰胺凝胶(page)电泳：25 μl pcr产物在电压100 v中电泳5 h。（4）电转移dna至杂交膜上:在半干燥电转移装置（美国bio-rad公司）上，800 ma 1 h，将dna转移至带正电尼龙膜（德国boehringer mannheim公司）上。（5）杂交和显色:以合成的(cag)10经地高辛标记后为探针，68℃杂交过夜后显色。

　　1.2.2　神经电生理检查　采用丹迪公司counterpoint肌电图仪和 mag 2型磁刺激仪在屏蔽室内进行。（1）sep：患者平卧，刺激腕部正中神经，参考电极置前额中央(fz)，耳垂接地，记录电极分别置erb点、c2和对侧头顶至外耳道连线中点处（相当于eeg10/20系统的c3′，c4′）。分别代表臂丛、楔束核和体感皮层的近场电位n9，n13，n20。刺激方波0.1 ms，3次／s，刺激强度10 ma。检测并计算外周神经传导时间(pcv)和中枢感觉传导时间(csct)。(2)mep：采用蝶形刺激线圈，外径12 cm，最大输出磁场强度2.5 t，频率带通2～10 khz，刺激时间200 μs。刺激点：大脑皮质运动区相对应的部位，第7颈椎棘突(c7)、erb点、肘、第4腰椎棘突(l4)及?窝。刺激量为最大输出的65％～80％。上、下肢记录部位分别为小指展肌和腓肠肌。计算中枢运动神经传导时间(cmct)。

　　2　结　果

　　2.1　dm患者家系检测结果　dm患者的两个家系中15名“无症状”个体基因ctg重复数也有不同程度改变，其中dm2家系中4名“无症状”个体(例12，13，14，17)ctg重复数均＜37个，临床亦无明显症状，但mep表现皮质刺激电位波幅低平1例，cmct轻度延长1例，其余2例正常；sep仅1例表现为pcv减慢，其余3例正常。两家系中其余11名“无症状”者，ctg重复数为60～1605个，dm患者例19的舅父(例20)ctg重复数也达130个以上，有临床表现，mep、sep明显异常(表1，2)。

表1　dm患者和家系中“无症状”个体与对照组sep参数值

　　tab 1　sep parameter of dm patients，“no symptom”

　　individuals and control group(x±s)

　　numbern9n13n20pcv

　　(v/m·s-1)n13-n9

　　(v/m·s-1)csct

　　(v/m·s-1)dm

580～1

　　605

11.04±

　　0.56

14.36±

　　0.41**

22.82±

　　0.47**

34.16±

　　2.01**

4.61±

　　0.68**

7.84±

　　0.83**no symptomdm11160～

　　160511.01±

　　0.5613.87±

　　0.86 **22.06±

　　0.40**46.59±

　　2.30 *4.21±

　　0.51**2.01±

　　0.61**dm24＜379.24±0.3613.47±0.6620.24±0.4356.48±2.362.67±0.666.48±0.54*control10＜308.79±0.4512.91±0.8119.10±0.6862.60±2.603.46±0.616.02±0.50

　　*p＜0.05 vs， **p＜0.01 vs control group

表2　dm患者和家系中“无症状”个体与对照组mep参数值

　　tab 2　mep parameter of dm patients，“no symptom”

　　individuals and coutrol group (x±s)

　　numbercmct

　　(v/m．

　　s-1)c7-

　　erb′serb′

　　s-musclec7-l4l4

　　-musclecerebral cortex-

　　musculus

　　abductor

　　digital minmi

　　manuscerebral

　　cortex-

　　musculus

　　gastrocne-

　　miusdm

580～

　　1605

14.29±

　　2.46**

3.76

　　±0.42**

14.31±

　　2.12**

18.66±

　　2.20**

24.62±

　　2.14**

32.78±

　　1.62**

57.39

　　±2.24**no symptomdm11160～

　　16059.46±

　　1.68*2.96±

　　0.5210.44±

　　1.80*14.92±

　　1.6020.20±

　　1.76*22.60±

　　1.31*43.88

　　±1.70*dm24＜379.21±

　　1.812.48±

　　0.449.46±

　　1.6112.24±

　　1.6319.63±

　　1.80*21.42±

　　1.321*41.00

　　±1.69*control10＜308.81±

　　1.602.62±

　　0.469.44±

　　1.5011.24±

　　1.1618.60±

　　1.7020.68±

　　1.2038.44

　　±1.60

　　*p＜0.05， **p＜0.01 vs control group

　　2.2　dm患者检测结果　5例住院临床确诊dm患者（表1中例1，8，18，19，21）基因ctg重复数为80～1 605个，明显高于正常人。其中例1，例18患者ctg重复数＞1605个，临床症状较重，四肢瘫痪，肌肉萎缩。mep、sep表现为：皮质刺激至肌潜伏期，上下肢均明显异常，其余3例患者ctg重复数80～300个，临床症状也相应较轻，但mep、sep也显示明显异常(表3)。

　　2.3　正常人检测结果　10名正常受检者经pcr扩增及地高辛杂交测出dm基因ctg重复数为19～30个，sep、mep各波形清晰对称，波幅、波宽、波峰、pl及ipl等参数均正常，重复性好。

表3　dm患者及其中3家系一般临床资料

　　tab 3　general clinical data of dm patients and 3 genealogies among them

　　copies

　　of ctgmep，sepdm11m45＞1 605cortex-muscle pl prolong，cmct， csct are prolong，

　　n13-n20 ipl are prolong2m48200cmct prolong n9， n13， n20 pl prolong3m42190cortex-muscle of， limbs pl prolong4m13＞1605cmct， csct of limbs prolong， cortical

　　potential low5f70200cortex-muscle of limbs pl prolong6f40380cmct， csct prolong， pcv slower7f13＞1605cmct， csct prolong， n9， n13， n20 pl prolongdm28m39300cortical potential is abnormal， cmct， csct prolong，

　　n9， n13， n20， n9-n13 prolong9m3660cmct prolong， n9-n13 prolong， pcv slower10f13＞1605cmct， csct prolong， n9， n13， n20 pl prolong11m42350cortex-muscle of limbs pl prolong， csct prolong12f1335　　　　　　（-）13m4330cmct， csct prolong14m935　　　　　　（-）15m45350cmct， csct prolong16f71150cortex-muscle of limbs pl prolong， csct prolong17m7630cmct， csct pl prolongdm318m52＞1605cortex-muscle of limbs pl prolong， csct， cmct prolongdm419m22130cmct， csct prolong， pcv slower，n9-n13 prolong20*m40130cortical potential is abnormal， cmct， csct prolong， amplify lowerdm521m2080cmct， csct prolong， n9， n13， n20 pl prolong， pcv slower

　　dm1-5 is clinical diagnosed hospitalized dm patients; the han nationality and no next of kin marriage; native palace of dm1 and dm2

　　are from shanghai; dm3-5 are from anhui; * mother’s brother of example 19

　　3　讨　论

　　dm是常见的神经肌肉疾病，主要临床表现为肌强直和进行性肌肉萎缩、常伴有心律失常、白内障、早秃、睾丸萎缩等症状，三核苷酸重复扩增突变发生于dm蛋白激酶的3′端非编码区［1］，该基因位于19号染色体长臂13.3区［2］，内含一个含g的保守序列，其编码的蛋白是一个atp结合位点，同时还含有一个丝氨酸-色氨酸、蛋白激酶的保守序列［3］。正常人在该位点的ctg重复数国外报道为5～37个［4］，国内报道为5～30［5］，与本研究正常对照组的结果(15～30个)相似。

　　5例住院确诊dm患者，其基因检测均不稳定，三核苷酸重复序列扩增现象与临床症状、mep和sep呈正相关表现。dm基因ctg重复数＞37个的2家系中“无症状”个体，mep异常率达76.9％，sep异常率达81.0％；而另4例基因ctg重复数＜37个，基因诊断在正常值内，但sep，mep异常率达50.0%，说明此病mep、sep的损害程度与dm基因三核苷酸ctg重复序列扩增突变密切相关。这些检查可为临床提供可靠的电生理学根据。

　　本组dm基因ctg重复数异常者，mep、sep皮质电位异常，上、下肢皮质刺激至肌潜伏期延长，伴cmct及csct延长，提示皮质运动区经皮质脊髓束至颈髓前角细胞的运动传出时间延长和从脊髓的楔束核经内侧丘系上行至端脑的体感皮质的感觉传入通路损害，mep、sep波幅低，重复性差，推测与脱髓的轴索变性、传导束纤维丧失有关［6］，此外，脑组织炎、外伤、缺血或脑部发育不全也可使潜伏期延长和波幅下降。

　　研究表明，采用dm基因三核苷酸ctg重复数检测，结合神经电生理检查，对我国dm家系中杂合子检出、症状前患者的确诊、家庭成员的婚姻咨询或产前诊断，都具有一定的实用价值。

　　作者简介：崔毅， 男，1949年10月生，副主任技师作者单位：第二军医大学长海医院神经内科，上海，200433?

　　参考文献

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　　2　schroder r， reyenburg s，weber j，et al.myotonic dystrophy and limb girdle muscular dystrophy in one family［j］. clin lavestig， 1994， 72(5):409

　　3　mahadevan m， tsilfides c， sabdurin l， et al. myotonic dystrophy mutation:an unstable ctg repeat in the 3′untranslated region of the gene［j］.science，1992， 25(5):1253

　　4　daumeric c， lannoy n， squifflet jp， et al. high ctg repeat number in nodular thyroid tissue from a myotonic dystrophy patient［j］.j med genet，1994，31(11):891

　　5　郑惠民，谢惠君，许金明，等. 上海地区91名正常人强直性肌营养不良基因ctg重复数测定［j］.第二军医大学学报，1998，19(3)：269

　　6　崔毅，郑惠民，丁素菊， 等. hmsn的磁刺激运动及体感诱发电位的检测［j］.中华医学杂志，1994，74(11):697