检测强直性肌营养不良(dm)病人的三核苷酸重复数目。方法　采用32p标记的pcr和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对3例dm病人的外周血和肌活检组织的ctg重复数目进行了分析。结果　3例dm病人ctg重复扩增片段分别为146bp、149bp和149bp，相应的ctg重复数为11、12、12，其基因型为11/11、12/12、12/12。结论　dm病人的ctg重复数目大多在50～4000不等，但是少数病人的ctg重复数目可在正常范围，一般认为是遗传异质性或基因突变所致。ctg重复数目正常的病人并不能排除dm的诊断。

强直性肌营养不良(myotonic dystrophy，dm)是常染色体显性遗传病，可累及多系统如骨骼肌、晶状体、心肺、胃肠道、中枢和周围神经、骨、皮肤和性腺，临床表现各异。任何年龄均可发病，临床上可见早发现象(anticipation)和不同的外显率(penetrance)。根据国外文献，多数dm病人ctg重复次数在50～2000不等，最高可达8000，而一般正常人的ctg重复次数在5～40之间。ctg的重复次数有种族特殊性和高度多态性［1～4］。我们采用32p标记的pcr、聚丙烯酰胺凝胶电泳对3例dm病人外周血和肌活检标本的ctg重复序列进行了检测。

1　资料和方法

临床资料　3例dm病人经我院临床诊断，符合《实用神经病学》标准［5］。例1，女性，29岁。自17岁起出现右上肢无力，以后出现左上肢无力、双下肢无力。23岁双手握拳后不能立即松开，上楼困难，眼睛、口唇不能闭紧。25岁结婚生一子，现已18个月。体检：面肌轻度萎缩，双眼及口唇闭合不全。四肢近端肌力3级，远端肌力5级，肌张力正常。右手握拳后不能松开。下蹲后不能立即起立。行走呈鸭步，额前秃发，轻度白内障。四肢腱反射迟钝对称。叩击性肌强直(+)。emg示肌源性损害，可见肌强直电位。例2，男性，40岁。16岁时出现双下肢无力，不能做重活，握拳后双手不能立即松开，以后症状逐渐加重，因性功能障碍而离婚。体检：面肌严重萎缩呈斧形脸，鹅颈，四肢肌力、肌张力正常。双手握拳后不能立即松开，双手叩击性肌强直(+)，轻度白内障，额前秃发，四肢腱反射正常。emg示肌源性损害，可见肌强直电位。例3，女性，为例2之妹。病情与例2类似，但程度较例2轻。体检：面肌萎缩呈斧形脸，牙齿排列不整齐，额前秃发，轻度白内障，四肢肌力、肌张力正常，双手叩击性肌强直。emg示肌源性损害，可见肌强直电位。

2　方　法

2.1　3例dm病人均经肌肉病理证实活检肌肉于-20℃冻存，按文献中常规方法制备外周血和肌活检组织dna［6］。

2.2　pcr反应体系　在pcr循环仪上(美国perkin-elmer9600型)，以正链5，-cttcccaggcctgcagtttgcccatc-3，负链5，-gaacggggctcgaagggtcctt-gtagc-3，为引物，反应体系10μl［10mmol/l tris-hcl］(ph 8.3)，1.5 mmol/l mgcl2，0.2mmol/l datp，dttp，dgtp，2μmol/l dctp，0.1μl α-32p-dctp(300mci/mmol)，5pmol正链引物，5pmol负链引物，50ngdna和1单位long-expand taq酶。每一标本均先将反应体系于95℃变性2min，最终72℃延伸7min。循环条件为94℃30s，62℃30s，70℃3min，共35循环。

2.3　电泳和放射自显影　配制7mmol/l尿素的6%变性聚丙烯酰胺胶。将10μl pcr产物与20μl上样液(95%甲酰胺，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚蓝和10mmol/l edta)混合，于80℃5min后取3μl上样，在42cm×33cm×0.4cm的96孔点样胶上作垂直电泳，恒压180v，电泳3h，并以m13mp 18的dna序列ladder为dna分子大小的标准。电泳结束后揭胶，烤干，暗室内压片，显影，读片并判断结果。

3　结　果

3例dm病人的外周血和肌肉组织dna的ctg重复数目相等，其扩增的分子量片段分别为146bp、149bp、149bp，相应的ctg拷贝数为11、12、12。3例病人的基因型分别为11/11、12/12和12/12(见表1)。

表1　病人不同组织dna的ctg重复数目

2

311

12

1211

12

12146bp

149bp

149bp11/11

12/12

12/12

4　讨　论

dm是由dmpk基因3，非翻译区ctg三核苷酸重复序列的异常扩增所致。ctg重复序列具有高度多态性和种族特殊性［1～4，7～14］文献报告正常人ctg重复数在5～40之间，多数dm病人ctg重复数目50～4，000不等，最高可达8，000［11］。但亦有少数dm病人ctg重复数目在正常范围的报告［7，8］。

dm是常染色体显性遗传疾病，多系统受累，可见肌肉萎缩，合并不同程度的肌强直、额前秃发、糖尿病、心肺异常、白内障、性功能障碍、特殊面容、智能障碍、睡眠过多、骨骼异常、大脑变性、周围神经受损等。多数作者报告欧美人发病率为1/18，000，davis等报告日本人发病率为1/18，000，ashizawa等报告东南亚人发病率较日本人低，非洲人发病罕见，仅dada于1973年报告了一个尼日利亚家系，国内尚无准确的发病率统计资料［1～4］。我们的病人经临床和病理证实，符合dm诊断，分子生物学检测ctg结果在正常范围。ctg重复扩增在不同组织中表达不同。jasen等报告ctg重复扩增在骨骼肌、心肌、平滑肌中表达明显，而在脑组织和内分泌组织中表达水平低［12］。daumerie等报告1例dm病人ctg重复数目在甲状腺中为外周血淋巴细胞中的7倍［13］。lavedan等检测了9种不同组织中的ctg重复数目，发现最小的扩增见于肝脏，最大的扩增见于肾脏［14］。但我们对3例dm病人的外周血和肌活检组织的ctg检测未能发现上述变化。发生上述改变的原因未明。wong等认为ctg重复扩增是动态突变，可随年龄的增长和疾病的逐渐加重而逐渐扩大［10］。临床上可见某些病人症状迁移数年而无加重。另外，thornton等［7］和reardon等［8］认为，ctg重复扩增在正常范围，说明dm有时可在无ctg重复扩增情况下发生，反映了dm基因位点的异质性。类似的情况可见于cgg重复扩增所致的脆性x综合征和不同基因突变所致的charcot-marie-tooth综合征。因此，虽然多数dm病人ctg重复扩增大于正常，但是有时ctg重复数目正常情况下，并不能排除dm的诊断。对上述3例dm的随访将有助于了解ctg的变化。

参考文献

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