目的　分析迪谢内/贝克肌营养不良症(dmd/bdm)基因缺失类型及其分布规律。方法　采用全长cdna探针和18对引物多重聚合酶链反应(mpcr)检测138例dmd/bmd。结果　用全长cdna探针，dna印迹法检测出86例患者基因缺失和4例重复，缺失率为62.3%。用18对引物mpcr检测出82例缺失，占全长cdna探针检出缺失的95.4%。结论　基因缺失的分布具有一定的规律性。86例缺失主要集中在两个缺失热区内，其中59例(68.6%)分布于外显子44～52，相当于cdna 8和7的3′端4个外显子覆盖的区域内。23例缺失(26.7%)分布于5′端外显子1～19，相当于探针1～2a和2b～3的检测区域内。仅4例(4.7%)缺失分布于基因的中心区。基因缺失的类型及分布与表型有一定关系。

the distribution of gene deletions in duchenne/becker muscular dystrophy　 liu yuge， dai zhihua， xie bingdi. department of neurological research institute， tianjin medical university general hospital， tianjin， 300052

【abstract】　 objective　 to analyse the locations and types of gene deletions in duchenne/becker muscular dystrophy(dmd/bmd). methods　 138 patients of dmd/bmd were screened with the complete cdna probes and multiplex polymerase chain reaction (mpcr) amplification of 18 pairs oligonucleotide primers. results　 86 deletions and 4 duplications were detected， the deletion frequency is 62.3%. 82 deletions were detected with 18 paris primers， which is 95.4% of deletions detected by complete cdna probes. conclusions　 86 deletions of dystrophin gene were clustered mainly in two high-frequency deletion regions， 59 cases(68.6%) located in the region of exons 44～52 corresponding to the area covered by the four exons in 3′ side of cdna 7 and cdna 8; 23 cases(26.7%) were in exons 1～19 of 5′ side corresponding to the area covered by the probes 1～2a and 2b～3; 4 cases(4.7%) were in the region covered by probe 4～5a in central region of the gene. the locations and types of deletion in dystrophin gene are associated with the phenotype of dmd/bmd.

【key words】　muscular dystrophy southern blotting multiplex polymerase chain reaction

由于dna重组技术的应用，迪谢内和贝克肌营养不良症(dmd/bmd)的基因诊断已精确到分子水平。目前致病基因已定位于x染色体短臂2区1带(xp21)，基因长2 300kb，含79个外显子，编码一个长14kb的mrna，基因蛋白产物是一种分子量为400 kd，位于肌细胞膜上的骨架蛋白——抗肌营养不良蛋白(dystrophin)。dystrophin基因缺失或重复导致dmd或bmd。随着dmd全长cdna的克隆和7个亚克隆cdna探针的应用，已经能够检测出基因突变的50％～67%［1，2］。近年来，chamberlain等［3］和beggs等［4］分别选择两组不同的最易发生缺失的位点设计了18对寡核苷酸引物，建立了检测本病基因缺失的多重聚合酶链反应(mpcr)新体系，使dmd/bmd的基因诊断方法更简便和准确。我们参照chamberlain等和beggs等提供的引物序列合成18对引物，对我院经临床、肌电图、血清酶学和肌活检确诊的138例dmd/bmd患者采用dna印迹和mpcr两种方法进行筛查，并对我国dmd/bmd基因缺失的分布规律进行分析。

对象和方法

一、对象

138例dmd/bmd均为我院住院或门诊患者。临床表现为四肢近端对称性进行性加重的肌肉萎缩，gowers征阳性，80%伴有腓肠肌假肥大等。肌电图检查显示肌源性改变，血清肌酸磷酸激酶含量显著增高，肌活检均显示特征性病理改变。依据丧失行走能力的年龄将患者分为四组:(1)dmd(94例)，13岁以前丧失行走能力;(2)中间严重型(8例)，13～16岁丧失行走能力;(3)bmd(31例)，16岁以后仍能行走;(4)5例10岁以下患儿归为一组（未分类）。30例正常对照均为非神经肌病的患者。

二、方法

1.dna印迹法:基因组dna按照kunkel等［5］的方法从外周血白细胞中提取，经hindⅲ(gibco brl)内切酶消化后，用0.85%琼脂糖凝胶电泳，再转移到hybond-n尼龙膜上。7个亚克隆cdna探针(1～2a，2b～3，4～5a，5b～7，8，9，10～14)由kunkel赠送，探针用 α-32p- dctp(3 000 ci/mmol，amersham)按照随机引物标记法进行标记(试剂盒由gibco brl提供)，按照amos等［6］的方法进行预杂交、杂交、洗膜，最后在-70℃行放射自显影。

2.mpcr:按照chamberlain等［3］和beggs等［4］提供的序列，由cybersyn生物工程公司合成18对引物，经寡核苷酸纯化柱(opc)纯化。将18对引物分为两组，分别对患者基因组dna进行pcr扩增。50 μl反应体系含670 mmol tris-hcl，166 mmol (nh4)2so4，67 mmol mgcl2，10 mmol β-巯基乙醇，10 μg/μl bsa， 250 mmol dntp (promega usa)，ph 8.0，每对引物各0.25 μmol，模板dna 500 ng。将反应液于97℃预变性10分钟，加入5 u taq dna聚合酶(bm，德国)，然后将反应液放入pcr热循环仪(perkin-elmer)中，按照94℃变性30秒，56℃复性30秒，70℃延伸2分钟，进行30次循环，最后在70℃延伸7分钟。取10 μl扩增产物，用2%琼脂糖在0.5×tbe中电泳，在紫外灯下观查结果并摄影保留结果。

结果

138例dmd/bmd患者中检出基因缺失86例(62.3%)，基因重复4例(2.9%)。基因缺失中dmd 61例(70.9%)，bmd 18例(20.9%)，中间型4例(4.7%)，未分类3例(3.5%)。86例缺失中用cdna 8检出47例(54.7%)，1～2a探针检出19例(22.1%)，2b～3探针检出16例(18.6%)，4～5a探针检出11例(12.8%)，5b～7探针检出33例(38.4%)，cdna 9探针检出11例(12.8%)。其中52例缺失用两个以上探针检出。用探针cdna 8，1～2a和2b～3检出的缺失占全部缺失的91.4%。用探针10～14未检出缺失。pcr扩增结果与dna印迹法分析结果一致，其中用第一组引物检出68例缺失，占全长cdna探针检出缺失的79.1%，在未检出缺失的患者中用第二组引物检出14例缺失，占全长cdna探针检出缺失的16.3%。两组引物检出缺失的总和占全部缺失的95.4%。86例缺失集中分布在两个热点区，其中外显子1～19缺失23例(26.7%)，44～52缺失59例(68.6%)，基因中心区外显子20～42缺失仅4例(4.7%)。

讨论

随着dmd全长cdna的克隆和7个亚克隆cdna探针的应用，目前已经能够检测出dmd/bmd基因突变的67%［2］。虽然dna印迹法分析步骤繁琐，但这一技术可以检测出迄今发现的人类最长的基因——dmd基因的全部缺失和重复，所以dna印迹法仍然是一种比较完善的检测手段。使用这一技术用7个亚克隆探针即可覆盖基因的全部外显子，并且能够确定缺失两端的边界类型和判断缺失的类型。本组用全长cdna探针对138例dmd/bmd进行基因检测，检出86例缺失，缺失率为62.3%。其中dmd 61例(70.9%)，bmd 18例(20.9%)，中间型4例(4.7%)，未分类3例(3.5%)。仅用探针cdna 8，1～2a和2b～3即可检出全部缺失的91.4%。

在对大量dmd/bmd基因缺失分析的基础上，chamberlain等［3］和beggs等［4］分别以9个不同的缺失热点外显子旁侧序列设计了两组引物，并联合应用这两组引物检测出用全长cdna探针检出缺失的98%。mpcr省略了dna印迹法杂交过程中的许多繁琐步骤，在不使用同位素的条件下，把至少需要1周完成的工作缩短至1～2天。本组参照上述引物序列合成两组引物(第一组:外显子4，8，12，17，19，44，45，48，51;第二组：启动子，外显子3，6，13，43，47，50，52，60)，分两步对138例dmd/bmd进行mpcr扩增，结果与dna印迹法分析结果一致。这一结果与文献报道的缺失检出率接近［4］。其中以外显子44，45，47，48，50，51和52缺失最多见。实践证明这两组引物完全适用于我国dmd/bmd患者的基因诊断。应该指出的是，由于这两组引物均未覆盖基因中心区域，4例相当于探针4～5a检测区域内的缺失漏检，漏检率为4.2%。本组用外显子60未检出缺失，可能与病例数较少有关。mpcr对基因缺失的诊断准确可靠，可以避免dna印迹法杂交过程中dna印迹转移不良或在杂交过程中出现气泡阻碍杂交而导致的诊断失误。

本组结果显示，dmd/bmd基因缺失的分布具有一定的规律性。86例缺失中59例(68.6%)分布于外显子44～52，相当于探针cdna 8和7的3′端4个外显子覆盖的区域内。23例(36.7%)缺失分布于5′端外显子1～19，相当于探针1～2a和2b～3的覆盖区域内，其中2例缺失累及外显子1。仅4例(4.7%)缺失分布于基因的中心区相当探针4～5a的检测范围内。因此，本组基因缺失的热点区主要集中在基因中心区3′端外显子44～52和5′端外显子1～19。这一结果与koenig等［7］报道的dmd/bmd两个缺失热区相一致。近来对基因缺失热区内含子44、45、49和50的研究发现其中存在许多小的重复序列，这些重复序列是基因重组的热点［8，9］。因此，这一特点可能是本病缺失热区突变率较高的原因之一。

本病临床表型与基因缺失部位和缺失类型有一定关系。本组2例患者基因缺失累及外显子1～4，因缺少起动基因和翻译的起始位点，表型为dmd。52例为移码缺失，因缺失破坏了阅读框架而导致蛋白翻译的中止，临床表现为严重的dmd。25例为整码缺失，其中大部分缺失位于外显子6～42，由于缺失部位并非基因的关键部位，部分基因功能保留，表型多为症状较轻的bmd。分析结果表明，90.9%的缺失符合monaco等［10］提出的翻译阅读框架理论。约1/3的dmd/bmd系由点突变引起，用目前的常规检测方法均不能检出。近来一些学者报道，用以pcr为基础的异双显性组和分析检测点突变获得成功［11］，值得进一步探讨。