迪谢内肌营养不良症基因治疗的评价和问题

迪谢内肌营养不良症是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性的x-性连锁隐性遗传性肌病。其发病率为男性活婴的1/3 500，患者通常3～5岁起病，主要表现为骨骼肌进行性近端无力、萎缩、腓肠肌假性肥大，12岁前丧失行走能力，通常于20岁左右因呼吸衰竭或心力衰竭死亡［1］。

分子病理学研究证实，由于dmd基因部分区域的缺失、重复或点突变，导致肌细胞膜上该基因编码的抗肌萎缩蛋白［2］（dystrophin，dys）的缺乏或结构变异，引起肌细胞膜的形态和功能损害，致使肌纤维变性坏死，故如何纠正dys在肌膜上的表达缺陷是根治本病的关键。

长期以来，临床学者一直试图以某种药物治疗本病，因没有涉及dys 基因的调节和表达，限制了其治疗dmd的疗效，正如wood［3］指出，至今还没有任何治疗方案能减缓和终止dmd的进行性肌损害进程。因此，有效的治疗必须将能表达dys 蛋白的正常基因移植到病变组织中，长期表达并产生足够数量的蛋白，既能够修复正在变性的细胞，又能补充已经变性丢失的细胞，从根本上防治本病。目前，已主要采用数种策略来修复肌肉中的dys蛋白，包括成肌细胞移植治疗（myoblast transfer therapy，mtt）、质粒和dna-脂质体的直接注射、修饰病毒载体的转染等介导外源性基因进入病变的肌肉及utrophin替代疗法［4， 5］。

一、 成肌细胞移植

骨骼肌在损伤后有杰出的再生功能，成熟的肌细胞存在一定数量的卫星细胞，能与外源性成肌细胞融合，继续分化成异核多核性肌纤维，修复损伤的肌肉，给成肌细胞移植治疗dmd带来契机。patridge等［6］首次提出，可以把mtt作为dmd/贝克肌营养不良症（bmd）基因治疗的策略之一，利用dmd的动物模型mdx小鼠实验，证实移植的成肌细胞可与宿主的肌纤维细胞融合，生成多核肌纤维和表达正常的dys 蛋白，纠正了肌纤维的变性、坏死等病理改变，膈肌的呼吸强度和深度也基本恢复正常。law 等［7］用dmd患者父亲或兄弟的肌肉组织分离纯化的成肌细胞，进行mtt治疗，同时使用免疫抑制剂环孢霉素a，发现患者肌肉中供体成肌细胞成簇状生长，并检测到部分患者肌力增强，有1例dys蛋白表达持续长达6年。然而，neumeyer等［8］对3例bmd 患者进行为期1年的mtt治疗，显示虽有少量肌纤维表达了dys蛋白，并未提高患者的肌力，认为只有进一步提高成肌细胞的移植效率，才能发挥mtt的潜在治疗作用。

成肌细胞移植与其他基因治疗相比有一些优点［5，7］：①骨骼肌细胞易于获取和移植；②成肌细胞能高度表达有活性的重组蛋白，并具有分泌特性；③可与宿主细胞融合，延长细胞存活，稳定表达外源性基因；④移植后不干扰相邻组织的生理功能。

但目前mtt仍然存在一些问题［4，5， 8］：①移植细胞的分布：成肌细胞的移植应分布在所有发病的肌组织中，包括心肌和膈肌，局部注射很难做到；②dmd患者心肌病变和智力缺陷仍然是mtt难以克服的，因为心肌细胞难以大量培养，且不互相融合，移植后的dys 蛋白仍局限于单个细胞中；③免疫排斥问题：在动物实验中，免疫抑制是mtt成功的关键，当小鼠成肌细胞移植于免疫相容宿主内可持续存在数月，而在免疫不相容的宿主则很快消失。对于同种异体移植，使用免疫抑制剂可保持供体细胞存活数月。然而，该方法是目前唯一能将人类自然基因组完整转移的方式，在dmd实验和临床研究已取得一定进展［4， 6］，是迄今为止唯一能应用于dmd临床的治疗策略。

二、 质粒直接注射

质粒直接注射是最简单的基因治疗策略，把目的基因插入表达载体的基因组内，直接导入目标组织或目标细胞，使目的基因在适合的启动子控制下表达，最终替补突变基因的功能。ascadi等［9］用纯化dmd cdna克隆直接注射入缺乏dys 的mdx鼠骨骼肌中，并发现在肌细胞中表达了dys 蛋白。decrouy等［10］治疗mdx鼠膈肌，报道只有少量肌纤维表达了目的基因。该方法优点是操作简单，且无病毒载体的生物危害性，但缺点是肌肉的dna摄取率很低，不能整合宿主细胞基因，有学者认为，目前只适用于非肌源性疾病的治疗［4］。

三、修饰病毒载体转染

近来，由于转输dys 基因广泛分布于肌细胞困难，基因治疗研究的焦点多集中在运载基因的病毒载体方面。

修饰逆转录病毒可用作载体介导目的基因进入动物骨骼肌细胞，其rna被逆向转录整合于宿主基因中。dunckley等［11］用逆转录病毒载体构建了一个能表达dys 微小基因的重组体，注射入mdx小鼠的骨骼肌中，结果5%～10%的肌纤维细胞摄取了重组体，并表达了dys 蛋白，且持续6个月以上。逆转录病毒载体的优点是能整合并稳定地保留在宿主细胞中，缺点是现用的载体仅能转染分裂期细胞，成熟的骨骼肌细胞则不敏感；对插入基因序列大小限制在8～10 kb，更大的插入序列将使表达效率降低。naldini等［12］研究获得过度修饰的hiv病毒，允许病毒基因整合非分裂期细胞，与其他慢病毒相似，能运载hiv dna进入细胞核，研究表明，修饰的hiv病毒可在体内转染小鼠神经元，高度表达目的基因lacz持续1个月以上，对肌细胞的转染有待研究。

腺病毒载体是目前将基因重组体引入骨骼肌的首选载体，ragot等［13］使用rous肉瘤病毒为启动子，将构建的6.3 kb dmd cdna微基因重组体插入腺病毒5型的e1a区，注射于新生mdx鼠，超过50%的肌纤维表达了dys 蛋白，但该蛋白是否可以纠正肌细胞变性坏死仍未明确。yang等［14］治疗mdx成鼠发现，在最佳的载体剂量和有效的免疫抑制下，dys表达超过2个月，肌肉的生理、病理得到改善，疗效和对肌肉毒性均有剂量依赖性。认为修饰复制缺陷型腺病毒载体比其他载体有以下优点：①容量增大，可编码36 kb双链dna；②转染组织广泛，可转染分裂后的肌细胞；③比较稳定，可在培养时获得高效价；④不引起插入突变，能对抗t-淋巴细胞和肿瘤坏死因子的毒性。但也存在一些问题［4］：①成熟肌细胞对腺病毒转染不敏感；②载体蛋白表达可诱发强烈的细胞免疫反应；③被转染的基因表达时间太短。

四、阳离子脂质体-dna注射

针对上述载体可诱发强烈的细胞免疫反应的缺点，trivedi等［15］采用阳离子脂质体作为物理性基因载体，以lacz为目的基因注入骨骼肌细胞可达40%的转染效率，将由劳斯肉瘤病毒启动子引导的重组人dys cdna环形质粒（＞18 kb），导入原代培养的正常鼠和mdx鼠成肌细胞，转染效率超过10%，且获得高水平dys表达，可肌肉注射或mtt移植。yanagihara 等［16］采用脂质体-日本血液凝聚病毒（hvj）复合体为载体，包裹全长人dys cdna，以劳斯肉瘤病毒为启动子，注入mdx鼠股四头肌，26%表达dys，在10 d内逐渐减弱。其优点是不产生抗原性蛋白，且载体容量较大。缺点仍然是广泛分布问题，表达时间短。

五、其他治疗策略

moisset等［17］采用腺病毒载体与成肌细胞联合的方法，将腺病毒介导dys基因转染体外培养的人成肌细胞，注入小鼠体内，注射部位的肌肉表达了dys基因，但缺点是表达数量和持续时间有限。

由于成人成肌细胞含量较少，体外细胞转染和扩增比较困难，有抗原性，影响细胞介导基因的效率。gibson等［18］发现，皮肤成纤维细胞在离体培养时可以和肌源性细胞融合成嵌合性肌小管，将正常鼠皮肤成纤维细胞植入mdx鼠肌肉，可融合成多核性肌细胞，在第3周49%～55%的肌肉中表达了dys。可见，皮肤成纤维细胞可高效率地融合在肌细胞中，因其易于取材和大量培养，可携带质粒dna进入肌细胞，可将皮肤成纤维细胞移植作为一种治疗策略，但在临床试验中效果不佳。

utrophin蛋白，由6号染色体上的基因编码，分子量430 kb，其结构组成和序列与dys 有85%同源性，有精确的互补性分配，推测具有相同或部分相同的功能，在dmd患者高度表达utrophin，理论上可弥补或替代dys的缺乏［19，20］。tinsley等［19］把截短的utrophin cdna用含人骨骼肌α-actin启动子的载体包裹，插入mdx鼠杂交母卵细胞， 发现utrophin在mdx子鼠体内高水平表达，修复dys-糖蛋白复合体所有成分，包括抗肌萎缩蛋白聚糖（dystroglycan）和肌糖蛋白（sarcoglycan）亚复合体，血清肌酸激酶水平和肌肉病理得到改善，并改善了骨骼肌和膈肌功能，增加自发活动的时间和幅度，认为可替代dys功能。gilbert等［20］用腺病毒介导utrophin在mdx鼠体内表达改善了肌肉病理，提高肌肉抗疲劳性。在dmd患者系统调节utrophin表达，可弥补dys的缺乏，为dmd治疗提供另一有效途径。此策略优点为：因dmd患者有正常的utrophin基因，不需要基因替代，不产生免疫反应。问题是如何诱导utrophin的表达，并使其长时间表达。

六、问题和展望

迄今为止，dmd的基因治疗仍存在许多问题［4， 5， 20］：（1）目的基因的获取：dys基因太大，达2 500 kb，操纵十分困难。质粒载体、修饰病毒或其他载体因受其容量限制，在dmd的基因治疗仍有局限性。（2）选择适宜的表达载体：修饰病毒载体虽可携带微基因，但缺乏侵染已经分化的肌纤维细胞的能力，载体蛋白具有抗原性，应用受到极大限制。（3）基因治疗的靶细胞太多，广泛分布于肌组织中。dmd基因转录启动和拼剪具有高度的组织和发育阶段特异性。（4）dys 基因的调节并不能修复已经变性的肌细胞，除非在年轻患者肌细胞还未开始变性时进行。（5）dys 及其相关蛋白的功能还不十分清楚，还没有dys 缺陷引起肌肉变性的直接证据，dmd患者肌细胞不仅缺乏dys， 也缺乏dys-相关蛋白，而后者的丢失也可产生细胞坏死、萎缩。

鉴于转输大量dys 蛋白和广泛分布于肌细胞的困难，dmd基因治疗中最理想的模式是通过系统播散的无致免疫性的方法，将与肌肉有特异性亲和力的载体包裹或连接目的基因，以受体介导或短暂感染的方式转入成熟肌细胞核内持续表达，产生治疗性蛋白，且不对宿主细胞产生生物危害。最近2年内，突破性的研究焦点仍集中在腺病毒介导dys基因移植和调节utrophin蛋白表达，未来的工作将继续探索多种基因治疗策略。